实验概要：本实验使用LOWRY法测定蛋白质含量，旨在为生物医疗领域提供准确的蛋白质分析方法。通过该方法，可以有效评估生物样本中的蛋白质水平，进而为研究和临床应用提供依据。

实验原理

LOWRY法是双缩脲法和福林酚法的融合与发展，其基本原理为：蛋白质溶液在碱性铜溶液中处理时，形成铜-蛋白质络合盐。随后，加入酚试剂后，不仅使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等发生显色反应，还增强了双缩脲法中肽键和碱性铜的显色效果。因此，LOWRY法的显色强度比单独使用酚试剂更强烈，其效果提升了3～15倍，而与双缩脲法相比则为100倍。此外，该方法通过增强肽键显色效果，降低了因蛋白质种类引起的测定偏差。

主要试剂

实验中使用的主要试剂包括：Na2WO4•2H2O、Na2MoO4•2H2O、85%H3PO4、浓HCl、Li2SO4•H2O、溴水、酚酞指示剂、Na2CO3、NaOH、CuSO4•5H2O、酒石酸钾钠，以及牛血清白蛋白（浓度为250mg/ml，使用水配制）。

主要设备

实验设备包括：若干试管、定量吸管（05ml、1ml、10ml）、定量加样器、圆底烧瓶、一套带橡胶管的冷凝管、微量滴定管、小烧杯、微量进样器（50μl），以及分光光度计。

实验步骤

1. 酚试剂的制备

(1) 首先，在1500ml的圆底烧瓶中加入100g Na2WO4•2H2O、25g Na2MoO4•2H2O及700ml蒸馏水，再加入85% H3PO4 50ml和浓HCl 100ml。装上回流冷却装置，缓慢加热沸腾10小时。冷却后，加入150g Li2SO4•H2O和50ml水，再次加入浓HCl 100ml，装上回流冷却装置，开口加热煮沸15分钟以去除多余的溴。冷却后将溶液稀释至100ml，并过滤到棕色瓶中，密封冷藏。使用时用标准NaOH溶液以酚酞为指示剂进行滴定，直至颜色从蓝色变为灰色。最终根据滴定结果调整酸浓度至1mol/L。

(2) 其次，配制4% Na2CO3溶液、0.2mol/L NaOH溶液、1% CuSO4溶液和2%酒石酸钾钠溶液。使用前，混合Na2CO3和NaOH成Na2CO3-NaOH溶液，并混合CuSO4与酒石酸钾钠，按50：1比例混合，制成Folin-酚试剂甲，此试剂应在当天使用。

2. 标准曲线的绘制

(1) 取7只试管，编号并分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用水补至1ml，分别得到每管蛋白质浓度为0mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg的标准系列（必要时可重复实验）。

(2) 加入5ml试剂甲，混匀后在30℃下放置10分钟。

(3) 喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混合，并在30℃下保温30分钟。

(4) 准确观察时间达到30分钟后，以未加入标准蛋白的管作为空白，在500nm波长下测定吸光度值。

(5) 根据蛋白浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

3. 样品测定

(1) 取50μl样液加入试管中（样液提取一般按0.1g鲜样/ml的比例，提取方法参见相关酶活测定方法），用蒸馏水补至1ml，随后重复步骤2中的（2）、（3）、（4），并以空白作为参考，测定吸光度值。

(2) 根据吸光度值，通过查阅标准曲线求得样品中蛋白质的含量。

4. 结果计算

蛋白质含量（mg/g鲜重）= (C * V / a) / W
其中C为查标准曲线得的样品测定管中蛋白质含量（mg）；V为提取液总量（ml）；a为测定时取样液量（ml）；W为取样量（g）。

注意事项

1. Folin试剂乙在酸性条件下稳定，因此在加入碱性的铜-蛋白质溶液后必须立刻混合，以确保反应能够及时进行，避免试剂被破坏。

2. 为确保反应的完全性，应在25～30℃的水浴中进行反应，反应30分钟后要及时进行比色测定。

3. 注意还原物质可能对实验结果造成干扰。考马斯亮蓝法和LOWRY法都是微克级高灵敏度的蛋白质定量测定方法。前者稳定，后者操作简便，两者均优于其他现有方法。值得注意的是：

• LOWRY法可能受到植物体内酚类物质的干扰；
• 考马斯亮蓝法在高蛋白质含量时线性关系稍微偏低，并且不同蛋白质与色素的结合状况有所差异。

在生物医疗研究中，选用准确的蛋白质测定方法至关重要，而尊龙凯时为科研提供了优质的试剂和设备，助力科学研究的顺利进行。