**人前列腺癌细胞VCAP培养指南**

一、细胞培养条件

细胞的最佳培养环境应维持在37℃、5% CO2的条件下，使用完全培养基以确保细胞的良好生长状态。

二、细胞收货后的处理

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，使细胞达到稳定状态后再进行处理。在显微镜下观察细胞的生长状况，并进行不同倍数的拍照保存（建议拍摄40x、100x和200x的照片）。前三天的照片将作为售后依据，如果未提供照片则默认细胞状态良好。

在传代后，建议将一瓶用原瓶的完全培养基进行培养，另一瓶则使用自制的完全培养基，以便于进行对比。在换液后请松开瓶盖。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

若细胞密度未超过80%，应将完全培养液收集并保留5ml，放入37℃、5% CO2孵箱中。如果细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次润洗。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞的消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟。弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液以1:2的比例进行分瓶传代（分入两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中。如后期需将细胞移入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护用品），快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬后，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因贴壁不牢而脱落，这是正常现象。如发现细胞脱落严重，可将所有培养液收集至离心管中，进行1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。对沉淀中的细胞加入1-2ml胰酶，轻轻吹打，重悬后再进行1-2分钟的消化，终止消化后再离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基进行重悬。之后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最终放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发情形及判定标准：

1. 在运输途中发生细胞丢失、瓶身破损、培养液严重泄漏等情况将予重发。
2. 如收到细胞后48小时内发现污染问题，请提供真实实验结果，经核实后将重发。
3. 常温发货的细胞如在静置24小时后或干冰冻存发货的细胞在复苏后24小时内绝大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片）将重发。
4. 如干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞在静置4小时后未开封但出现污染，将予重发。
5. 细胞活性问题请在收到产品7天内提供真实实验结果，经认证后将重发。
6. 收到细胞当天及后续2、3天需拍照，未在3天内提出异议将视为产品合格。若在4-7天内出现问题并提供前3天的照片及详细操作记录，经过技术人员认定责任问题的，则重发。

2）细胞问题不予重发的情况：

1. 客户造成的细胞污染不重发。
2. 客户不当操作导致细胞状态不良不重发。
3. 非本库推荐的细胞培养体系造成细胞状态不良不重发。
4. 细胞状态不佳且未提供培养前3天照片的不予重发。
5. 细胞培养过程中经其他处理的不予重发。
6. 在收到后2天内未告知问题的不予重发。
7. 具体情况需进一步评估。

在进行细胞培养与操作时，请遵从上述指导，确保细胞的健康状态，并期待通过尊龙凯时为您提供的优质支持与服务。