活细胞染料（如CFSE）与胞内蛋白的共价结合使得在细胞分裂过程中，染料能够均匀分配至子代细胞中，随着代次的增加，荧光强度逐代减半。借助流式细胞术检测这一荧光衰减，可以有效追踪细胞的增殖代数。

染料标记过程

在进行T细胞的染料标记时，使用CFSE（浓度为1-5μM）进行避光孵育10分钟。随后，使用冷却的培养基终止刺激培养，接着采用抗CD3/CD28抗体或ConA进行激活，培养时间为48-72小时。通过流式细胞分析检测荧光强度，使用FlowJo软件拟合分裂峰，能够追踪至少8代的细胞分裂，并兼容多色流式分析（例如：CD4/CD8/活化标志物的联合使用），动态反映增殖的异质性。

需要注意的是，高浓度的染料可能具有细胞毒性，因此需进行适当的浓度优化。此外，流式细胞仪的应用场景包括基因修饰T细胞的功能评估、免疫抑制剂的动态药效分析及亚群增殖差异研究。

英诺思产品推荐

在T细胞CFSE增殖实验中，可能需使用以下尊龙凯时产品以确保实验的顺利进行：

• 小鼠T淋巴细胞培养基（含血清） 货号：C400250
• 细胞分选缓冲液（EasylsoBuffer） 货号：EISO0500
• 1XPBS 货号：B0150001
• ActBeads™ Mouse T细胞激活磁珠（大包装） 货号：AM2001
• LeEasyIso™ mouse CD3 T细胞分离试剂盒 货号：SN4101
• EasyIso™ mouse CD4 T细胞分离试剂盒 货号：SN4102
• EasyIso™ mouse CD8 T细胞分离试剂盒 货号：SN4103
• EasyIso™ mouse Naive CD4 T细胞分离试剂盒 货号：SN4104
• EasyIso™ mouse CD19 B细胞分离试剂盒 货号：SN4001

增殖细胞的定量分析方法

在细胞的DNA合成期，增殖细胞可摄入胸腺嘧啶类似物（如BrdU或EdU），并利用抗体检测（BrdU）或点击化学反应（EdU）对增殖细胞的比例进行定量分析。

BrdU法中，首先刺激培养，在T细胞激活后加入BrdU（浓度为10μM）进行4-24小时的孵育，随后通过乙醇或甲醛固定，使细胞膜破裂。再经过酸/酶解步骤暴露DNA，以抗BrdU抗体结合后，使用荧光二抗进行检测，最终通过流式或荧光显微镜进行分析。

EdU法推荐使用，由于其不需要抗体的检测，流程更为简便：培养中直接加入EdU（10μM），通过Cu⁺催化实现EdU与荧光染料的偶联。

增殖细胞的代谢评估

增殖细胞的线粒体代谢增强时，还原性染料（如MTT/XTT）会产生有色产物，其吸光度（OD值）与活细胞数量成正相关。诱导的刺激培养中，可以将T细胞接种于96孔板中，并施加激活剂。对于染料的添加，MTT法是通过在培养结束前4小时加入MTT（0.5mg/mL），随后用DMSO溶解甲臜来实现，而推荐的CCK-8法则是直接加入CCK-8试剂（10%），孵育2-4小时后读取数据。

这两种方法操作简便，无需特殊设备，且具有高通量（适合药物筛选），CCK-8的毒性低且数据更为稳定，但需注意其仅间接反映增殖情况（代谢活性≠增殖），容易受到凋亡或坏死细胞的干扰。

总结

不同增殖检测方法的适用场景包括免疫抑制剂的初步筛查、疫苗佐剂效果的评估以及大规模的增殖表型鉴定等。针对动态追踪亚群差异的研究，可以选择CFSE方法（例如Th17与Treg的增殖动力学），而固定时间点的增殖率检测则可采用EdU（因其操作更快速且免去变性步骤）。高通量化合物筛选可利用CCK-8法（适合96/384孔板）。

通过结合CFSE和EdU双重标记方法，研究者能够同时分析细胞的分裂代数与S期细胞的比例，但需配置多激光流式仪器。掌握这三种方法的原理与优化要点，尊龙凯时的支持将为您的T细胞增殖研究需求提供精准的数据支撑，助力免疫机制探索与治疗开发。